《金田一少年事件簿R第二季》讲述名侦探金田一耕助的孙子金田一一和青梅竹马的好友七濑美雪等人解决一个个疑案的故事。金田一少年事件簿R改编自天树征丸原作，漫画家佐藤文也作画的著名长篇推理漫画「金田一少年事件簿」。
故事发生在天之御船学园一年级七班内，这是一个十分特殊的班级，这里汇聚的，是背负着“负之业”的不幸少女们。虽然一辈子都没走过运但依然对生活充满了希望的花小泉杏（花守由美里 配音）、陷入了绝对不会有结果的单恋之中的云雀丘琉璃（白石晴香 配音）、体弱多病，常年缠绵病榻的久米川牡丹（安野希世乃 配音）、无时无刻不在迷路中的超级路痴萩生响（山村响 配音）、总是散发着吸引雌性生物的荷尔蒙并因此感到十分困扰的江古田莲（吉冈茉佑 配音）。 这些孩子们，虽然各有各自的不幸，但每一天依然努力的生活着，希望能够在不幸的间隙中找到属于他们的幸福。
小学生木之本樱（丹下樱 配音）是一个平凡的女孩，有一个温柔的爸爸木之本藤隆（田中秀幸 配音）和一个体贴的好友大道寺知世（岩男润子 配音）。一天，在父亲的书房中她发现了一本尘封已久的魔法书，并无意间解除了书上的封印，一只会说话的玩偶可鲁贝洛斯（久川绫 配音）出现在了她的面前。小可告诉她，自己是守护这本书的神兽，书中封印着名叫库洛牌的东西。现在，封印解除了，它要小樱成为库洛魔法师，它将协助她收复这些四处捣乱的库洛牌。隔天，小樱的班上转来了一个名叫李小狼（熊井素子 配音）的转学生，这个外表酷酷的男孩原来也是冲着库洛牌而来。 随着库洛牌的封印，越来越多的角色出现在了小樱的身边，而他们的真正目的，却还不得而知。
